- 優(yōu)質血清助力細胞學實驗 -

上期內(nèi)容里，我們介紹了細胞轉染的基本基本知識，包括概念、應用場景以及各種方法之間的優(yōu)劣對比。

本期內(nèi)容，進一步為大家介紹常用的細胞轉染方法——實操篇。

- 細胞轉染常用方法 -

陽離子脂質體介導的轉染

原理：陽離子脂質體介導的轉染是目前常用的轉染方式之一。

陽離子脂質的基本結構由帶正電荷的頭基和一個或兩個烴鏈組成。

帶正電荷的頭基與帶負電荷的核酸通過靜電作用形成復合物。

經(jīng)細胞的內(nèi)吞作用進入細胞。

實驗過程：將DNA，RNA，siRNA或寡核苷酸和轉染試劑分別在不同的管中稀釋→將兩者混合形成混合物→將形成的混合物加入細胞中，脂質體的正電荷有助于幫助復合物粘附到細胞膜上→復合物經(jīng)細胞內(nèi)吞作用進入細胞→檢測基因表達或沉默情況。

磷酸鈣共沉淀

原理：將DNA與氯化鈣在磷酸緩沖鹽水中混合形成磷酸鈣-DNA沉淀物，然后將其分散在培養(yǎng)的細胞上，磷酸鈣促進共沉淀物中的縮合DNA與細胞表面的結合，DNA通過內(nèi)吞作用進入細胞。

實驗過程：將氯化鈣和DNA混合，以可控的方式加入磷酸緩沖液→在室溫下孵育，以形成極細，可溶的共沉淀微粒→將磷酸鈣-DNA沉淀物加入細胞中，后者能黏附到細胞膜表面→共沉淀物經(jīng)細胞內(nèi)吞作用進入細胞→檢測基因表達或沉默情況。

病毒轉染

原理：對于用脂質體不能實現(xiàn)轉染的細胞，可以采用病毒轉染。腺病毒，逆轉錄病毒和慢病毒載體已廣泛用于哺乳動物細胞體內(nèi)外的基因轉染。

 

實驗過程：通過基因克隆方法獲得重組病毒表達載體→轉染包裝細胞系，擴增并分離得到重組病毒顆粒→純化并滴定病毒液→轉導目的細胞（含病毒特異性的受體）→從培養(yǎng)基中移除病毒→檢測基因表達或沉默情況。

電轉

原理：利用電脈沖在細胞膜上形成暫時的孔使核酸物質能穿過孔進入細胞。

實驗過程：利用電轉緩沖液重懸細胞→對含有核酸，緩沖液，細胞的混合物給予合適的電脈沖→電脈沖在細胞膜上形成電勢差，誘導產(chǎn)生暫時的孔使核酸進入細胞→將細胞返回到生長培養(yǎng)基中，使其慢慢恢復→檢測基因表達或沉默情況。

血清在細胞培養(yǎng)過程中的重要性不言而喻：

• 提供對維持細胞指數(shù)生長的激素，基礎培養(yǎng)基中沒有或量很少的營養(yǎng)物，以及主要的低分子營養(yǎng)物。

• 提供結合蛋白，能識別維生素、脂類、金屬和其他激素等，能結合或調(diào)節(jié)它們所結合的物質活力。

• 有些情況下結合蛋白質能與有毒金屬和熱原質結合，起到解毒作用。

• 是細胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質上所需因子來源。

• 起酸堿度緩沖液作用。

• 提供蛋白酶抑制劑，使在細胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活，保護細胞不受傷害。

• 參與細胞凍存。

• ......

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